Технико-экономическое обоснование мультимодальной нелинейной эндоскопии с использованием многожильных пучков волокон для дистанционного сканирования от срезов тканей до объемных органов

Том 13 научных докладов, Номер статьи: 13779 (2023) Цитировать эту статью

283 доступа

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Здесь мы сообщаем о разработке и применении компактного многожильного оптоволоконного зонда для мультимодальной нелинейной визуализации, сочетающего безметочные методы когерентного антистоксового комбинационного рассеяния, генерации второй гармоники и флуоресценции с двухфотонным возбуждением. Датчики с такой конструкцией многожильного волокна не содержат движущихся частей и частей, находящихся под напряжением, на дистальном конце, что обеспечивает улучшенную совместимость с клиническими требованиями по сравнению с конкурирующими реализациями. Рабочие характеристики зонда устанавливаются с использованием тонких криосрезов и искусственных мишеней, а затем оценивается применимость к клинически значимым образцам с использованием ex vivo объемных тканей кишечника человека и свиньи. После реконструкции изображения для противодействия пиксельной природе данных записанные изображения демонстрируют высокое качество изображения и морфохимическое соответствие на уровне ткани по сравнению с мультимодальными нелинейными изображениями, полученными с помощью лазерного сканирующего микроскопа с использованием стандартного объектива микроскопа. Кроме того, представлена простая, но эффективная процедура реконструкции, которая дает удовлетворительные результаты. Наконец, намечен четкий путь дальнейших разработок, призванных облегчить внедрение мультимодального волоконного зонда в реальную клиническую оценку и применение.

Визуализация тканей in vivo без меток, предоставляющая как морфологическую, так и химическую информацию, имеет решающее значение для многих предполагаемых медицинских применений, особенно для интраоперационного неинвазивного гистопатологического исследования тканей. За последние годы было показано, что объединение различных спектроскопических методов в мультимодальном подходе к визуализации полезно для удовлетворения всех требований к скорости, глубине проникновения и молекулярной специфичности1,2,3. Одним из таких подходов является микроскопия когерентного антистоксового комбинационного рассеяния (CARS), которая одновременно генерирует два других нелинейных эффекта: двухфотонную возбужденную флуоресценцию (TPEF) и генерацию второй гармоники (SHG) в одном устройстве визуализации. CARS позволяет картировать определенные молекулярные колебания, при этом наиболее часто выбираемые из них указывают преимущественно на липиды (например, ~ 2855 см-1, νs(CH2)) или белки (например, ~ 2930, νs(CH3)), оба из которых изобилуют биологическими образцами. Напротив, TPEF можно использовать для воздействия на эндогенные аутофлуорофоры, особенно НАД(Ф)Н, который повсеместно присутствует в тканях из-за его важности для клеточного метаболизма. Более того, ГВГ — это процесс, происходящий только в нецентросимметричных материалах, что делает его весьма специфичным для квазикристаллических биоматериалов, таких как коллагеновые волокна или нити миозина. Таким образом, объединение этих трех нелинейных модальностей дает ценную информацию о морфохимии ткани без использования меток.

В этом контексте мы продемонстрировали, что мультимодальная нелинейная микроскопия, сочетающая CARS, SHG и TPEF, позволяет обнаруживать характерные структуры и сопутствующие молекулярные изменения широко распространенных заболеваний, особенно рака4,5. Чтобы облегчить интерпретацию данных изображений CARS/SHG/TPEF, передовые алгоритмы обработки изображений могут автоматически извлекать характерные свойства6,7. Кроме того, наряду с автоматической оценкой, можно было бы показать, что информация, закодированная в этих мультимодальных изображениях, записанных без меток, также может быть переведена в компьютерные изображения гематоксилина и эозина (H&E)8 с помощью многомерной статистики, которая не только задействует существующую совокупность изображений. знания и подготовка медицинских работников, но также могут помочь в переходном принятии. Для создания таких компьютерных изображений H&E и/или для обеспечения автоматизированной оценки данных мультимодальной нелинейной визуализации, включая классификацию заболевания или визуальную сегментацию в качестве основы для дальнейшего принятия клинических решений, на месте и непосредственно во время операции, используются компактные ручные эндоскопические устройства. необходимы. Поскольку сценарии применения варьируются от обнаружения границ опухоли в хирургических ранах до исследования симптомов, выявления, классификации и мониторинга заболеваний в полых органах (например, воспалительная болезнь кишечника9), разработка эндоскопических устройств для нелинейной спектроскопической визуализации стала предметом значительного интереса. на протяжении многих лет. Были представлены различные подходы: помимо точечных сканирующих датчиков10, наиболее распространенными являются сканирующие волоконные эндоскопы11,12,13,14,15,16,17,18 и использование гальвосканирующих зеркал или сканеров микроэлектромеханических систем (МЭМС)19,20,21, 22,23,24.

90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>